CRISPR用于人类iPS可以揭示基因在特定疾病中起到的作用,甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPS在实验室中已经相当普及了,但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系,推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPS和人胚胎干细胞同样适用。
研究背景
肌联蛋白(TITIN)是一个巨大的肌小节蛋白,具有复杂的、分子折叠的功能,对肌肉细胞的舒张和收缩起重要作用。
导致Titin蛋白翻译截断的变异(TTNtv)是扩张型心肌病(DCM)中最常见的致病变异,约占20%。大部分的致病TTNtv
都集中在A带区域,而I带区域上发生的TTNtv则是可以耐受的。临床上还鉴定出大量的TTN错义突变,临床意义尚不明确。
建立一个有效的DCM模型将有利于变异分类、疾病机制研究和下游药物开发。
研究思路:建系&分化—疾病表型模拟—分子水平分析—小分子测试
1)建立病人/正常人的iPS细胞并分化成为心肌细胞;同时利用CRISPR-Cas9系统在野生型iPSC中引进特异变异
“p” patient- derived;
“c” CRISRP/Cas9-derived mutations
2)心肌细胞水平上未见肌张力变化相关表型,但是在心肌细胞3D培养形成的类器官上可以观察到生理水平的变化;进一步检测到肌节异常
3)RNA-seq用于分子水平分析,揭示TGFβ通路及VEGF通路下调
4)VEGF处理可以提高变异的心肌类器官的肌张力水平,为药物开发提供可能的靶点
研究背景
杜氏肌营养不良(DMD)
1)X染色体连锁的隐性遗传疾病;幼儿期(3-5岁)发病,肌无力,进行性加重,大约12岁失去独立行走能力,
易患扩张型心肌病,通常在20岁前死于肺炎、呼吸衰竭或者心力衰竭
2)致病原因:DMD基因功能缺失,主要变异类型是大片段缺失或者移码突变
贝氏肌营养不良(BMD)
1)晚发型肌无力,通常寿命可以达到40岁以上;症状较DMD轻微
2)致病原因:DMD基因功能部分缺失,主要变异类型是小片段in-frame缺失或者错义突变
DMD基因非常大,过去的基因治疗策略大部分是过表达截短的Dystrophin蛋白来部分回复蛋白功能
外显子跳跃策略在DMD治疗中的应用
针对移码突变型的DMD,把发生移码突变的一小段外显子整个去除,得到一个中部截短的蛋白,依然能行使大部分功能——DMD变成BMD。
研究思路
1)利用CRISPR-Cas9技术,在Exon两端设计两个sgRNA作用位点,切掉相关外显子区域
2)一步到位,从基因层面缓解DMD
技术团队 | 项目经验 | 结题项目 | 项目服务 |
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